熒光染料會(huì)結(jié)合到DNA的A-T福集區(qū)域，因?yàn)橹гw的DNA中A-T含量高（55%-80%），所以可將其染色而檢測(cè)。這種方法是利用熒光染料（bisbenzimide,Hoechst33258）檢測(cè)支原體污染。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后在細(xì)胞核外與細(xì)胞周?chē)煽吹皆S多大小均一的熒光小點(diǎn)，即為支原體的DNA，證明有支原體污染。
有簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)與靈敏，廣泛使用的特點(diǎn)，可作為例行的檢測(cè)手段。可以檢測(cè)不易培養(yǎng)的支原體，例如M.hyorhinis，比直接培養(yǎng)法快，約一周既可知道結(jié)果。但有時(shí)會(huì)有背景熒光，影響結(jié)果判斷。
所使用的材料如下：
Hank''s balanced
saltsolution（不含NaHCO3和酚紅，HBSS，GibcoBRL21250-014）、二苯并噻唑（bisbenzimide，HoechstNo.33258，SigmaB-2883）、thimerosol（Sigma
T-5125）、0.1M檸檬酸、0.2M磷酸氫二鈉、甘油、冰醋酸、甲醇、無(wú)菌水、chamber
slide（Nunc177380）或其替代物：35或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)放無(wú)菌22x22mm蓋玻片（浸于酒精中用前過(guò)火滅菌），染色后取出蓋玻片細(xì)胞面朝下放玻片上觀察。
指示細(xì)胞：Vero（ATCCCCL-81或CCRC60013）或3T6（ATCC
CCL-96或CCRC60070），細(xì)胞須先測(cè)試無(wú)污染。MEM，10%FBS（Vero的培養(yǎng)液）。
試劑準(zhǔn)備：無(wú)菌HBSS：配置Hank''s balanced salt solution，用0.22um無(wú)菌濾膜過(guò)濾除菌。 Hoechst33258
儲(chǔ)存液（100x）：稱(chēng)取5.0mg二苯并噻唑和10.0毫克thimersol溶于100ml無(wú)菌HBSS，置于棕色瓶中，室溫下以電磁攪拌器攪拌30分鐘至完全溶解后，以1ml/支分裝到1.5ml小離心管中，-20℃保存。
Hoechst 33258 工作液：取1ml儲(chǔ)存液加入100ml無(wú)菌HBSS中，室溫下攪拌45分鐘，置于棕色瓶中并以錫箔紙包裹，避廣光保存于4℃。
封固溶液（mounting solution）：22.2ml0.2M
檸檬酸和27.8ml0.2MNa2HPO4加入50ml甘油中，用1NNaOH調(diào)pH至5.5（pH很重要），4℃保存。
固定液：冰醋酸：甲醇=1：3（v：v），用前配置。
操作流程：
1.培養(yǎng)Vero細(xì)胞：Vero細(xì)胞可作長(zhǎng)期培養(yǎng)或制作多個(gè)凍存管，測(cè)試前解凍培養(yǎng)。測(cè)試前一周培養(yǎng)Vero細(xì)胞。
2.在接種待測(cè)樣品前一日，將Vero細(xì)胞以1-2x104細(xì)胞/ml培養(yǎng)于chamber
slide中，每孔加入1ml細(xì)胞懸浮液，于37℃，5%CO2培養(yǎng)。隔日確定生長(zhǎng)良好后即可接種待測(cè)樣品細(xì)胞。
3.接種待測(cè)樣品：樣品種類(lèi)：1ml待測(cè)的培養(yǎng)基，1ml待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液（可刮下少許細(xì)胞）0.05-0.1ml 冷凍管的細(xì)胞懸浮液。
4.將待測(cè)樣品加入chamberslide內(nèi)培養(yǎng)5天后，進(jìn)行Hoechst33258的熒光染色觀察。
5.以Acholeplasmalaidlawii ATCC23206感染Vero細(xì)胞作陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照用Vero細(xì)胞的新鮮培養(yǎng)基（MEM+10%FBS）。
DNA熒光染色檢測(cè)：
6.取出培養(yǎng)5天的Vero細(xì)胞，吸除培養(yǎng)液。每孔加2ml固定液，靜置十分鐘后吸除固定液，重復(fù)一次，風(fēng)干10分鐘。
7.每孔加入1mlHoechst33258 工作液，室溫下靜置30分鐘。
8.吸掉Hoeshst33258染液后，用無(wú)菌水洗滌3次，風(fēng)干后加入1滴封固溶液，并以蓋玻片蓋之。
9.用100-400x熒光顯微鏡觀察。打開(kāi)汞燈10分鐘后，用UV激發(fā)光（330-380nm）的濾光鏡，觀察細(xì)胞核外是否有蘭色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)的熒光。
結(jié)果判斷：如有支原體污染，在Vero細(xì)胞核外與細(xì)胞表面會(huì)出現(xiàn)蘭色熒光小點(diǎn)或絲狀點(diǎn)。其形狀一致，與細(xì)胞殘片染成的不規(guī)則點(diǎn)狀物不同。其熒光可維持?jǐn)?shù)周。
